PCR實驗代測的模板濃度
更新時間：2024-01-02 點擊次數：215次PCR實驗代測的模板濃度
服務內容：
1.制定個性化實驗方案：根據不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內參；
2.檢測類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；
3.樣本抽提及質檢：對客戶提供樣本進行RNA抽提，并利用NanoDrop進行樣本質檢；
4.定量PCR預實驗：包括樣本反轉錄為CDNA、配置PCR反應體系及進行Real-TimePCR反應；
5.正式定量PCR實驗：根據預實驗結果進行正式實驗；
6.數據分析：采用2- △△CT法進行分析，比較不同樣本間差異。
影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間
反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
Real-time qPCR常見參數
基線（baseline）通常是3-15個循環的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。
如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。
另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時，兩個數值之間相關的可信度很好。
PCR實驗代測的模板濃度
